Rola lamelarnych warstw lipidowych w procesie przenikania substancji przez skórę

Proces przenikania substancji leczniczych i ko- smetycznych przez skórę jest zdeterminowany budową warstwy rogowej naskórka. W jego po- wierzchniowej części, pomiędzy ściśle do siebie przylegającymi martwymi komórkami, zwany- mi keratynocytami, występuje macierz lipidowa. Lamelarna struktura lipidowych przestrzeni międzykomórkowych warstwy rogowej na- skórka o wysoce hydrofobowym charakterze jest główną drogą transportu substancji przez wierzchnią część skóry i jednocześnie efektyw- ną barierą. Prowadzone są badania naukowe mające na celu poznanie macierzy lipidowych naskórka oraz odnalezienie nowych kierunków modyfikacji jej struktury i właściwości fizyko- chemicznych zwiększających jej przepuszczal- ność dla związków kosmetycznych i leczniczych. W artykule przedstawiono badania spektrosko- powe w podczerwieni osłabionego całkowitego odbicia IR-ATR (Infrared Spectroscopy - Atte- nuated Total Reflectance) przedstawiające kon- formacyjne rozluźnienie struktury modelowej dwuwarstwy lipidowej w obecności flufenazyny, które może prowadzić do wzrostu przepusz- czalności tak zmodyfikowanych błon lipidowych. Słowa kluczowe: przenikanie przez skórę, lipidy warstwy rogowej naskórka, badania IR-ATR, flufenazyna

Skóra

Płaszcz tłuszczowy skóry, składający się z wydzieliny gruczołów łojowych, wody wydzielanej przez gruczoły potowe oraz z lipidów pochodzących z komórek naskórka, kwaśny odczyn skóry (pH 4.2-5.6), jak również obecność keratyny zapewniają ochronę przed szkodliwymi czyn- nikami chemicznymi. Działanie antybakteryjne skóry polega na utrzymywaniu kwaśnego odczynu płaszcza tłuszczowego i jednoczesnym wysychaniu naskórka oraz stałym procesie złuszczania go, przez co bakterie zostają usunięte w sposób mechaniczny. Ochrona przed czynni- kami fizycznymi polega na:

– powstawaniu melaniny, która chroni skórę i tkanki pod nią przed promieniowaniem UV, – ochronie przed ciepłem i zimnem, czyli regulacji cieplnej (zwiększanie lub zmniejszanie utraty cie- pła). Dodatkowo skóra uczestniczy w metabolizmie lipidów, węglowodanów, białek i witamin, w regulacji gospodarki wodno-elektrolitowej oraz w procesach odpornościowych.

Skóra składa się ze skóry właściwej (dermis) oraz po- krywającego ją od zewnętrznej strony naskórka (epider- mis) z warstwą rogową (stratum corneum). Między naskór- kiem a skórą właściwą znajduje się błona podstawowa o bezkomórkowej strukturze. Komórki warstwy podsta- wowej (stratum basale) ulegają ciągłym podziałom, dając początek keratynocytom naskórka. Od 2 do 4 tygodni trwa proces przemieszczania się keratynocytów z war- stwy podstawowej do warstwy rogowej, gdzie w najbar- dziej zewnętrznych jej obszarach ulegają one złuszczeniu. W okresie tym komórki w wyniku keratynizacji tworzą strefę martwych komórek stratum corneum, złożoną z około 15-20 warstw. Podczas keratynizacji w warstwie ziarnistej z lipidów tworzą się tzw. ciałka lamelarne, któ- re podczas obumierania keratynocytów wydzielane są do przestrzeni międzykomórkowych. Struktura warstwy rogowej przypomina swoją budową model muru, w któ- rym cegły stanowią martwe, ubogie w lipidy i obficie zaopatrzone w białka (głównie w a-keratyny) keratyno- cyty, a zaprawę murarską – macierz zawierającą lipidy (ceramidy, cholesterol), wolne kwasy tłuszczowe, a także enzymy kataboliczne, które powodują przekształcanie się lipidów ze związków polarnych w niepolarne, nieroz- puszczalne w wodzie. Lipidy tworzą na drodze krystalizacji tzw. płaszcz lipidowy. Schemat struktury warstwy rogowej naskórka przedstawiono na rysunku 1.

Przestrzenie międzykomórkowe stratum corneum wy- pełnione są lipidami ułożonymi w uporządkowane struk- tury laminarne, których jednostką podstawową jest po- dwójna warstwa lipidowa [1]. Hydrofilowe ugrupowania polarne lipidów zwrócone są do siebie, a pomiędzy nimi znajdują się warstwy wody (Rys. 1). Cząsteczki lipidu są związkami amfifilowymi, tzn. posiadają w swej struk- turze obszar o charakterze polarnym i rejon niepolarny. Część hydrofilowa (polarna), zwana inaczej hydrofilową „główką”, reprezentowana jest przez polarne grupy fosfo- ranowe, karboksylowe, hydroksylowe, cholinowe itd. Ob- szar hydrofobowy (niepolarny) stanowią długie łańcuchy węglowodorowe, zwane hydrofobowymi „ogonami” czą- steczek lipidowych. Cząsteczki amfifilowe tworzą agre- gaty, których struktura zależy między innymi od kształtu budujących je cząsteczek lipidowych, rodzaju środowiska, w którym powstają, temperatury, siły jonowej czy pH. Dwuwarstwa lipidowa jest termodynamicznie stabilną i jedną z najczęściej przyjmowanych form agregacji lipi- dów budujących żywe komórki. Dwuwarstwowe struk- tury lipidowe wypełniające przestrzenie między komór- kami keratynocytów powstają w wyniku lamelarnego ułożenia cząsteczek lipidowych kontaktujących się ze sobą główkami polarnymi, a w obszarze hydrofobowym węglowodorowe łańcuchy przylegają do siebie wzdłużswej długości. Jedna monowarstwa kontak- tuje się z drugą poprzez obszar hydrofobowy. W ten sposób powstaje dwuwarstwa lipidowa, która przylega do drugiej dwuwarstwy swo- ją polarną powierzchnią (Rys. 1). Przestrzeń między dwuwarstwami lipidowymi ma cha- rakter wysoce hydrofilowy i wypełniona jest cząsteczkami wody, które odpowiadają mię- dzy innymi za stopień nawilżenia skóry oraz za wzrost stopnia wchłaniania związków ko- smetycznych i leczniczych. Rzeczywistą barierę w przenikaniu sub- stancji przez skórę stanowi martwa warstwa rogowa na- skórka, przez którą substancje dyfundują głównie lipido- wą drogą międzykomórkową. Przez warstwę rogową skóry substancje dyfundują ponad tysiąc razy wolniej niż przez żywe warstwy skóry, głównie z powodu ścisłego przylega- nia keratynocytów i lamilarnie ułożonych lipidów otacza- jących komórki. Niepolarny charakter warstwy rogowej sprzyja przenikaniu substancji lipofilowych, niepolarnych, niezjonizowanych i o niskiej masie cząsteczkowej.

W dużym uproszczeniu warstwę rogową naskórka można traktować jako szereg membran lipidowych, które musi po- konać dyfundująca cząsteczka. Proces przenikania substan- cji aplikowanej w nośniku (podłożu) na skórę można uznać za dyfuzję bierną, którą opisuje pierwsze prawo Ficka (1):

J=K×D×∆C /L

gdzie: J - ilość substancji dyfundującej - szybkość dyfuzji

(kg/cm2 x h), K - współczynnik podziału substancji między warstwę

rogową a podłoże, D - współczynnik dyfuzji substancji w warstwie rogowej

ΔC - różnica stężeń substancji po obu stronach membrany – warstwy rogowej (kg/cm3), L - długość drogi dyfuzji – grubość warstwy rogowej (cm).

Współczynnik K (podziału substancji między warstwę rogową a podłoże) trudno wyznaczyć eksperymentalnie z uwagi na złożoność struktury warstwy rogowej, dlate- go do obliczeń zwykle stosuje się wartość współczynnika podziału substancji między n-oktanolem a wodą. Związki, dla których wartości logarytmu dziesiętnego współczyn- nika podziału substancji n-oktanol/ woda (log P) wynoszą od 2 do 4, najchętniej i najszybciej przenikają przez skórę.

Zdolność ksenobiotyków do przenikania przez skórę zależy od właściwości fizykochemicznych substancji pe- netrującej, rodzaju nośnika, z którego substancja w po- staci rozpuszczonej musi się uwolnić, i drogi penetracji. Wydajność transportowania oraz przenikania substancji leczniczych lub kosmetycznych wzdłuż warstwy rogo- wej naskórka może być regulowana zmianą stopnia upa- kowania, uporządkowania i uwodnienia warstw lipido- wych przestrzeni międzykomórkowych. Dwuwarstwa lipidowa w temperaturze zwanej temperaturą głównego przejścia fazowego (Tm) podlega głównemu przejściu fazowemu, podczas którego błona lipidowa ze sztywnej, ściśle upakowanej i wysoce uporządkowanej fazy żelowej przechodzi w rozluźnioną i nieuporządkowaną struktu- rę fazy ciekłokrystalicznej (Rys. 2). Wzrost temperatury dostarcza do układu energię, która pozwala na tworze- nie konformerów gauche z energetycznie korzystniejszej konformacji trans grup CH2 w łańcuchach węglowodoro- wych cząsteczek lipidów. Wprowadzenie konformeru gau- che zakrzywia łańcuch węglowodorowy cząsteczki lipidu, przez co jej kształt staje się bardziej nieregularny (Rys. 2). W zakresie niskich temperatur, tzn. przed głównym przejściem fazowym, w fazie żelowej grupy CH2 węglo- wodorowych ogonów lipidowych przyjmują głównie kon- formacje trans. W tym stanie cząsteczki lipidu z prostymi, niezakrzywionymi łańcuchami węglowodorowymi przyj- mują regularny kształt walca, dzięki któremu jest możli- we ścisłe i dokładne dopasowanie cząsteczek lipidowych w dwuwarstwie lipidowej. W fazie żelowej odległości mię- dzy lipidami są minimalne, przez co ograniczona zostaje głębokość penetracji cząsteczek wody w głąb błony. Wraz z podwyższeniem temperatury, w fazie ciekłokrystalicz- nej następuje wzrost odległości pomiędzy nieregularnie ułożonymi cząsteczkami lipidowymi. To sprzyja powsta- waniu wolnych przestrzeni i wypełnianiu ich, głównie w części powierzchniowej błony, przez cząsteczki wody. Rozluźnienie struktury błony, której towarzyszy wzrost jej uwodnienia, ułatwia przenikanie bardziej polarnych substancji przez warstwę rogową skóry.

Założenia badań własnych

Upłynnienie struktury błony lipidowej może nastąpić pod wpływem temperatury oraz związków, które flu- idyzują dwuwarstwy lipidowe, np. detergenty. Związki z grupy fenotiazyn wykazują silne powinowactwo do struktur lipidowych i w większości zbadanych przypad- ków znacząco obniżały temperaturę głównego przejścia fazowego, wprowadzając błonę w rozluźniony stan cie- kłokrystaliczny [2-5]. Zbadano, iż należąca do fenotiazyn flufenzyna (FPh), której strukturę przedstawiono na rys. 3, wywołuje w błonie konformacyjne rozluźnienie, którego poziom ściśle zależy od ilości związku wprowadzonego w strukturę dwuwarstwy lipidowej (Rys. 4).

Spektroskopia w podczerwieni osłabionego całkowi- tego odbicia IR-ATR (Infrared Spectroscopy - Attenuated Total Reflectance) pozwala śledzić zmiany konformacyjne grup CH2 w łańcuchach węglowodorowych cząsteczek lipidów. Drgania rozciągające symetryczne i antysyme- tryczne grup metylenowych (ns,asCH2) odzwierciedlają zmiany w stosunku konformerów trans do gauche.

Materiały i metody

Jajeczną sfingomielinę (SM) zakupiono w Avanti Polar Li- pids, czystość wynosiła > 99%. Dwuchlorowodorek flufe- nazyny (FPh) zakupiono w Jelfa, Jelenia Góra, Polska.

Przygotowanie liposomów: liposomy o składzie SM/ FPh przygotowano w następujących stosunkach molo- wych obu składników: 90/10 mol%, 80/20 mol%, 70/30 mol%, 60/40 mol% i 50/50 mol%. Ilość użytego lipidu wynosiła 10 mg. Suchy film SM/FPh otrzymano poprzez odsuszenie roztworu o składzie metanol/chloroform (1:1) na ściance kolbki okrągłodennej. W wyniku hydra- tacji suchego filmu jednym mililitrem wody (Millipore, Mili Q) otrzymano dyspersję liposomową, którą poddano ekstruzji przez membranę o średnicy 100 nm (LiposoFast z polikarbonylową membraną, Avestin, Kanada).

Pomiary IR-ATR: otrzymaną dyspersję l iposomo- wą naniesiono na kryształ ZnSe (10-odbiciowy, Specac) i prowadzono badania w funkcji temperatury. Widma re- jestrowano z rozdzielczością 2 cm-1 (128 skanów) na spek- trometrze Nicolet Magna 860 FT-IR.

Wyniki i wnioski

Wzrost udziału konformerów gauche przesuwa maksi- mum pasm ns,asCH2 w kierunku wyższych częstości, do- datkowo obniża się ich intensywność oraz ulegają one poszerzeniu.

Domieszkowane flufenazyną błony lipidowe przyjmu- ją strukturę rozluźnioną, nieuporządkowaną i bogatą w konformery gauche, co sprzyja wzrostowi ich przepusz- czalności dla różnych substancji. Głębokość penetracji cząsteczek wody wzrasta dla rozluźnionych dwuwarstw lipidowych, przez co błona staje się bardziej uwodniona i polarna. Pochodne fenotiazyny mogą stanowić poten- cjalne czynniki zwiększające nawodnienie i zmiękczenie lipidowej macierzy warstwy rogowej skóry, a tym samym mogą przyczynić się do podwyższenia wydajności skórne- go wchłaniania związków kosmetycznych i leczniczych.

Źródło: www.kosmetologiaestetyczna.com